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产品FAQ

His标签蛋白纯化常见问题解答

发布时间:2019-05-15 13:16:13 点击次数:

Q:层析柱堵塞?

A:待纯化蛋白样品中存在固体杂质,多见于菌体裂解液直接上样。建议对样品微滤 (0.45μm) 处理。


Q:目的蛋白不与介质结合?

A:

• 目的蛋白没有 His 标签,其原因可能是载体构建有误、表达提前终止 (C端融合表达His 标签)、二级翻译起始 (N端融合表达His标签)等等。建议测序检查,或尝试更换表达载体。

• His标签折叠在蛋白质内部没有暴露。该情况多见于包涵体蛋白在变性条件下的纯化。建

议充分变性蛋白,可以尝试使用更强的变性剂 (如用6 M盐酸胍代替 8 M尿素)、加入助溶剂 (SDS) 或还原剂 (DTT、β-巯基乙醇) 等方法。

• 缓冲液存在问题。使用 Ni-NTA 或 Ni-IDA 介质纯化 His 标签蛋白时,平衡缓冲液与样品缓冲液中的某些组分可能会干扰目的蛋白的结合。

部分组分建议浓度如下 :

 EDTA: ≤0.1 mM (建议不要使用)

 DTT: ≤1 mM (不推荐使用)

 β-巯基乙醇: ≤20 mM (慎用)

 咪唑: ≤20 mM (因蛋白而异)


Q:洗脱液中杂蛋白多?

A:

• 洗脱条件不合适。建议使用咪唑浓度梯度或 pH 值梯度洗脱。不同蛋白质最佳洗脱条件不同,需要摸索优化。

• 杂蛋白与介质存在非特异性结合。建议在平衡缓冲液与样品缓冲液中加入一定浓度的咪唑 (推荐浓度 : ≤20 mM,因蛋白而异),抑制非特异性结合。

• 杂蛋白与目的蛋白存在非特异性结合。建议在平衡缓冲液与样品缓冲液中加入非离子型去垢剂 (Triton X-100: ≤1%)、甘油 (≤10%)、NaCl (≥300 mM)、还原剂 (β- 巯基乙醇 : ≤20 mM) 等组分。

• 目的蛋白降解。建议在低温下纯化目的蛋白,并在平衡缓冲液与样品缓冲液中加入蛋白酶抑制剂 (如 PMSF)。

• 存在表达提前终止 (C 端融合表达 His 标签) 或二级翻译起始 (N端融合表达 His 标签)。建议更换表达载体。


Q:目的蛋白没有洗脱?

A:

• 目的蛋白量太少,无法检出。建议更换灵敏度更高的检测方法,如用银染法或 Western Blot 替代考马斯亮蓝染色,或优化上游表达条件,获得更多的目的蛋白。

• 目的蛋白没有结合介质。建议检测以下全部样品以确认蛋白:上样前、流出、洗涤、洗脱。

• 目的蛋白结合牢固。建议增加洗脱强度,如采用更高浓度的咪唑或更低的 pH 值。


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