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q 【Trans 实验常见问题和解答】蛋白纯化及检测 -- 使用几次以后发现镍柱的载量下降,挂柱效率降低,如何处理? HisTrap 或 Ni 填料怎么进行有效的再生或清洗?

a 如果镍柱的载量下降或者挂柱效率降低,可能是由于逐渐积累的沉淀、变性或非特异结合的蛋白占据了有效的结合位点,而通过洗脱液无法彻底清洗所致。建议可以采用不同的清洗方法来提高载量:
1) 较温和的清洗方法
为了去除沉淀或变性物质,可以尝试用2倍柱体积的6M盐酸胍或8M尿素洗涤,然后用 5倍柱体积的缓冲液洗涤;为去除疏水结合的物质,可以尝试 2倍柱体积1%的Triton X-100洗涤,然后用5 倍柱体积的缓冲液洗涤。若改变不明显,可以选择下面更强烈的清洗方法。
2) 更强烈的清洗方法
首先用 5-10倍柱体积的脱镍缓冲液(20 mM 磷酸钠, 0.5 M NaCl, 50 mM EDTA, pH 7.4)洗涤,迚行脱镍操作,然后用5-10倍柱体积的平衡缓冲液冲洗,最后用 5-10 倍柱体积的双蒸水冲洗;随后迚行清洗操作,去除离子型杂蛋白,可以用5倍柱体积的 1.5 M NaCl 溶液,然后 10倍柱体积的双蒸水冲洗;去除沉淀或变性蛋白,可以用1M 氢氧化钠溶液,结合 1-2 小时,然后用10倍柱体积的平衡缓冲液和 10倍柱 体积的双蒸水迚行冲洗;去除疏水蛋白或者脂蛋白,可以用 5-10 倍柱体积的 30%异丙醇溶液清洗,然后 10 倍柱体积的双蒸水洗涤;最后迚行生镍操作,用 0.1M 硫酸镍上柱,随后5倍柱体积的双蒸水和平衡缓冲液迚行洗涤,如需保存,保存在 20%乙醇溶液即可。

q 【Trans 实验常见问题和解答】蛋白纯化及检测 -- HIS 标签蛋白洗脱后杂带较多,什么原因? 如何优化?

a 高纯度的蛋白是纯化工作者的追求,但是由于很多天然的蛋白也会带有 HIS,所以经常会出现 HIS 标签蛋白洗脱后有一些杂带。
可能原因:蛋白酶部分降解了标签蛋白
策略:请添加蛋白酶抑制剂,(慎用 EDTA)。
可能原因:杂质对镍离子有更高的亲和性
策略1:咪唑浓度必须优化,以确保高纯度(宿主细胞蛋白质的低结合)和高产率(组氨酸标记的目标蛋白质的强结合)之间的最佳平衡。分步或者线性洗脱摸索出最优的咪唑结合和清洗浓度;在样品中加入与结合缓冲液同样浓度的咪唑;咪唑的梯度不大(20 个或更多的柱床体积),可能分离出有相似结合强度的蛋白。
策略 2:筛选最适合的缓冲液条件,NaCl 浓度,pH 的范围都需要进行筛选。
策略 3:若以上优化的条件都不能去除杂质蛋白,需要考虑多步纯化的思路,离子交换 (HiTrap Q HP or HiTrap SPHP) 和凝胶过滤 (Superdex™Peptide ,Superdex 75 or Superdex200) 是必须的.以下是用ÄKTAxpress仪器进行四步纯化的实例。AC(亲和),DS(脱盐),IEX(离子交换),GF(凝胶过滤)所有的步骤都在ÄKTAxpress上自动执行,包括柱上的标签酶切。
可能原因:杂质和标签蛋白结合在一起
策略:在超声破碎细胞之前加入去垢剂或者还原剂;增加去垢剂的浓度, ( 2 % Triton X-100 or 2 % Tween 20);或者在 wash buffer 中增加甘油的浓度(50%)减少非特异性的相互反应;考虑增加咪唑的浓度或者改变金属离子。
可能原因:洗涤不充分
策略:增加洗涤的次数,使洗涤充分

q 【Trans 实验常见问题和解答】蛋白纯化及检测 -- 蛋白若没有洗脱下来

a 可能原因:洗脱条件太温和(组氨酸标记的蛋白质仍然结合在柱上,结合力较强)。
策略:用增加咪唑的梯度洗脱或降低 pH 来找出最佳的洗脱条件。
可能原因:降低 PH 的方法洗脱的,因为若 pH 低于 3.5,会导致镍离子脱落
策略:改变洗脱办法,咪唑竞争性洗脱
可能原因:蛋白已沉淀在柱上
策略:减少上样量,或使用咪唑的线性梯度而不是分步洗脱以降低蛋白的浓度。试用去污剂或改变NaCl 的浓度,或在变性条件(去折叠)下洗脱(用4-8 M脲,或4-6 M 盐酸胍)。
可能原因:非特异性疏水或其他相互反应
策略:加非离子去污剂到洗脱缓冲液(如, 2%Triton X-100)或增加NaCl 的浓度。

q 【Trans 实验常见问题和解答】蛋白纯化及检测 -- His 标签蛋白没有结合

a 可能原因:超声的功率不对(太大,蛋白炭化,太小,蛋白没有释放)
策略:改变超声功率,并在超声前加入溶菌酶
可能原因:样品或者是结合缓冲液不正确
策略:检测 pH 及样品和结合缓冲液的组成份。确保在溶液 中鳌合剂或强还原剂的浓度及咪唑的浓度不是太高。
可能原因:组氨酸的标签没有完全的暴露
策略:在变性条件下(用 4-8 M 脲,或 4-6 M 盐酸胍)进行纯化。
可能原因:His标签丢失
策略 1:WB 或者 anti-His的抗体检查 His是否表达,上游构建,改变 his-tag的位置(C-terminal or N-terminal),必要时增加 his个数(常用 6-10个)。
策略 2:孵育的时间不够,降低流速和增加孵育的时间。
策略 3:改变螯合的金属离子,寻找到最佳的结合金属离子。
Ni2+通常是从宿主细胞蛋白中纯化大多数(组氨酸)6 标记的重组蛋白质的首选金属离子,也是一般最常用的离子。蛋白和金属离子之间的结合强度受几种因素影响,包括长度、位置、亲和标记在蛋白的暴露程度、所用离子的类型、以及缓冲液的 pH,因此一些蛋白用其他离子可能更容易地进行纯化而不用 Ni2+。可以利用 Hitrap IMACHP 来筛选不同的金属离子,具体应用实例请参考《Recombinant Protein Purification Handbook》。

q 【Trans 实验常见问题和解答】原核表达 -- 提高目标蛋白的稳定性的措施有哪些?

a (1)利用蛋白转运系统把目标蛋白最终积累在周质空间或分泌到培养基中;
(2)采用缺乏某些蛋白水解酶基因的缺陷株作为宿主菌;
(3)对分子量较小的目标基因进行融合表达或串联聚合表达;
(4)共表达能提高特定目标蛋白稳定性的辅助因子,如分子伴侣基因;
(5)对蛋白质序列中的蛋白水解酶敏感区域和识别位点进行改造;
(6)在较低温度下培养菌体和优化发酵条件。