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q 【Trans 实验常见问题和解答】蛋白质电泳 -- SDS-PAGE电泳的基本原理?

a SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳,是在聚丙烯酰胺凝胶系统中引进SDS(十二烷 基硫酸钠),SDS会与变性的多肽,并使蛋白带负电荷,由于多肽结合SDS的量几乎总是与多肽的分子量成正比而与其序列无关,因此SDS多肽复合物在丙稀酰胺凝胶电泳中的迁移率只与多肽的大小有关,在达到饱和的状态下,每克多肽可与1.4g去污剂结合。当分子量在15KD到200KD之间时,蛋白质的迁移率和分子量的对数呈线性关系,若将已知分子量的标准蛋白质的迁移率对分子量对数作图,可获得一条标准曲线,未知蛋白质在相同条件下进行电泳,根据它的电泳迁移率即可在标准曲线上求得分子量。

q 【Trans 实验常见问题和解答】蛋白纯化及检测 -- GST 标签蛋白不能被高效的洗脱

a 可能原因:
洗脱缓冲液的体积不够增加洗脱缓冲液的体积。
对策:
有些情况下,尤其是柱上酶切有标签蛋白时,需要更大体积的缓冲液来洗脱标签蛋白。洗脱的时间不够通过降低洗脱过程中的流速来增加洗脱时间。
可能原因:
谷胱甘肽的浓度不够增加洗脱缓冲液中谷胱甘肽的浓度。
对策:
10mM 浓度对于大多数应用来说足够了,但是也存在例外。尝试使用 50mM Tris-HCl,20-40mM 还原型谷胱甘肽,pH8.0作为洗脱缓冲液。
可能原因:
洗脱缓冲液的 pH 过低增加洗脱缓冲液的pH 值。
对策:
将 pH 增加到8-9会增强洗脱而不用提高洗脱所用谷胱甘肽的浓度。
可能原因:
洗脱缓冲液的离子强度过低。
对策:
增加洗脱缓冲液中的离子强度,在洗脱缓冲液中加入 0.1-0.2M 的氯化钠也会使结果变好。
可能原因:
洗脱缓冲也中的谷胱甘肽被氧化了。
对策:
使用新鲜的洗脱缓冲液。加入 DTT。
可能原因:
非特异的疏水相互作用导致蛋白和柱材非特异的结合或聚集,从而阻止了标签蛋白的溶解和洗脱。
对策:
向洗脱缓冲液中加入非离子去垢剂。加入 1%的 TritonX-100 或 2%的 n-octylglucoside 可以显著提高某些 GST标签蛋白的洗脱。电泳或蛋白质免疫印迹检测发现多条条带
可能原因:标签蛋白被蛋白酶部分降解
对策:
加入蛋白酶抑制剂。多条条带可能是由于目的蛋白被蛋白酶部分降解的结果。在裂解溶液中加入 1mM PMSF 可能会使结果变好。

q 【Trans 实验常见问题和解答】蛋白纯化及检测 -- GST 标签蛋白不结合柱子或结合非常弱。

a 可能原因:
GST标签蛋白被机械裂解的方法变性(比如超声)。
对策:
过分的裂解会使标签蛋白变性,阻止其结合。在裂解过程中,用温和的机械/化学裂解条件。裂解的条件必须依照经验来决定。GST 标签蛋白在样品中有聚集,导致沉淀在细胞裂解前加入 DTT,在缓冲液中也加入 DTT。1-20mM 的 DTT 会显著增加某些 GST蛋白的结合。
可能原因:
标签蛋白的浓度过低
对策
浓缩样品。结合能力是浓度依赖的。低表达量的蛋白可能不会像高表达量蛋白那样有效地结合柱子。因此,浓缩样品会提高结合。标签蛋白可能改变了 GST的构象,因此降低了 GST标签蛋白的结合能力。
检测所使用的 pGEX 载体中 GST 的结合。准备带有所使用的 pGEX 的细胞超声裂解物,检测其与柱材的结合。如果结合的很好,则可能是标签蛋白改变了 GST的构象,因此降低了GST标签蛋白的亲和力。可以通过降低结合的温度到4°C 限制洗涤来改善结果。
可能原因:
平衡时间太短
对策:
确认柱材至少用 5 倍柱体积的 pH6.5 到 8.0 的缓冲液平衡过(比如 PBS)。GST标签蛋白在pH值低于6.5和高于8时结合效率低在净化好的样品上样前用pH6.5到 8.0的缓冲液平衡过(比如 PBS)。
可能原因:
样品上样过程中的流速过高
对策:
降低在上样时的流速。影响 GST 标签蛋白结合的一个重要参数就是流速。由于GST与谷胱甘肽相对慢的结合,在样品上样过程中保持低流速以获得最大结合能力很重要。

q 【Trans 实验常见问题和解答】蛋白纯化及检测 -- 填料是否可以重复使用?可以使用多少次?

a 如果维护的好的话,填料在其效期之内可以一直重复使用。如果每次都是同 样的蛋白迚行纯化没有必要剥离掉镍离子重新挂镍,一般经过 5-7次纯化之后可以迚行脱镍和再生镍的再生操作。如果柱子反压高了,填料需要做彻底的清洗,在清洗之前,为了避免金属盐的沉淀,需要剥离掉镍离子,然后再重新挂镍,清洗后保存在 20%的乙醇中。

q 【Trans 实验常见问题和解答】蛋白纯化及检测 -- 镍柱使用中出现棕色是怎么回事?

a 出现这样的情况,主要是缓冲液中 DTT 的影响, DTT 会对镍柱的颜色和纯化效率有很大的 影响,在碱性的缓冲液条件下,镍离子会被DTT还原生成棕色的沉淀,所以所有镍柱的生产商都强调要尽量避免DTT 的参与。
1)5倍柱体积的双蒸水洗柱;
2)5倍柱体积的平衡液洗柱;
3)5倍柱体积的洗脱液洗柱;
4)10倍柱体积的平衡液平衡。