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q 【Trans 实验常见问题和解答】细胞培养 -- 冷冻管应如何解冻?

a 取出冷冻管后,须立即放入37℃水槽中快速解冻,轻摇冷冻管使其在1分钟内全部融化,并注意水面不可超过冷冻管盖沿,否则易发生污染情形。另冷冻管由液氮桶中取出解冻时,必须注意安全,预防冷冻管之爆裂。

q 【Trans 实验常见问题和解答】Western Blot -- 什么都曝不出来

a 看膜上有无预染条带,有的话证明转膜没问题;
检查一抗、二抗、发光液是否好用,显影液定影液配制时间不能太长,重新 进行实验;

q 【Trans 实验常见问题和解答】Western Blot -- estern marker曝光太亮

a 缩短曝光时间,用咱们的发光液十几秒即可;
较少marker上样量,但同时预染条带也会较弱;

q 【Trans 实验常见问题和解答】Western Blot -- Western blot 结果中信号弱或无信号

a 可能的原因:
蛋白未转到膜上
对策:
转膜结束后,用总蛋白染色剂染胶来确定转膜效率。(注:总蛋白染色剂 可能检测不到低量的抗原。)
确保转膜过程中胶与膜完全接触。
确保转印夹层排布正确
确保按照膜的制造商的使用说明润湿膜
确保转印部件在电印迹过程中未过热
使用正对照和/或分子量Marker
优化转印时间和电流
确保样品制备条件优于蛋白印迹,为破坏样品的抗原性。(注意:许多蛋 白不能在还原状态下进行)
可能的原因:
蛋白未完全结合到膜上
对策:
在转膜缓冲液中加入20%的甲醇促进结合。低分子量的抗原可能会穿过转印膜,需使用小孔径的膜进行。
可能的原因:
抗体不足
对策:
增加抗体浓度。抗体与目标蛋白的亲和力可能很小
抗体可能失活,可用斑点印迹检测其活性。
可能的原因:
抗体浓度太高
对策:
使用太多一抗或二抗可能导致信号迅速消失,呈现出很弱的信号。
可能的原因:
抗原不足
对策:
加入更多的蛋白进行跑胶
抗原被封闭液掩蔽
试用不同的封闭液
优化封闭液中蛋白浓度
可能的原因:
缓冲液中含有叠氮钠
对策:
叠氮钠是一种HRP的抑制剂,缓冲液不能使用叠氮钠作为防腐剂
可能的原因:
曝光时间太短
对策:
延长胶片的曝光时间(注意:超感应化学发光底物会持续发光至少6个小时
可能的原因:
底物孵育时间太短
对策:
使用超感应底物时需规定时间的底物孵育

q 【Trans 实验常见问题和解答】Western Blot -- Western blot 结果中背景高且不均匀

a 可能的原因:
抗体浓度太高
对策:
一抗或二抗浓度太高会导致高背景,降低抗体浓度
可能的原因:
使用的封闭液不兼容
对策:
对比不同的封闭缓冲液
可能的原因:
非特异性位点封闭不足
对策:
优化封闭缓冲液,最好的封闭缓冲液具有系统依赖性
提高封闭液中蛋白的浓度
优化封闭时间和/或温度。室温封闭至少1 h或者4℃封闭过夜
在封闭液中加入Tween-20,Tween-20的终浓度为0.05%
可能的原因:
封闭液中与其它蛋白发生抗体的交叉反应
对策:
换一种不同的封闭液
不要用含抗生素蛋白的牛奶封闭,牛奶含生物素
交叉反应的检测。封闭一张干净的膜,与抗体一起孵育,然后用超感应化学发光底物检测
可能的原因:
洗涤不充分,增加洗涤次数和使用缓冲液的体积
对策:
降低HRP结合物的浓度
如果洗涤液中无Tween-20,添加Tween-20使其终浓度为0.05%
可能的原因:
膜的曝光时间过久
对策:
缩短印迹膜曝光到胶片的时间
按照说明书的指示,保证膜始终是湿润的
用一张新膜
保证膜完全被液体覆盖,避免其干燥
在孵育过程中始终进行震荡
小心夹膜——损坏膜可能导致非特异性结合
不能空手持膜,始终带干净手套或用镊子
可能的原因:
缓冲液污染或结块沉淀
对策:
制备新的缓冲液
可能的原因:
抗体浓度太高
对策:
若一抗和/或二抗浓度过高会产生高背景,降低抗体浓度
可能的原因:
缓冲液中有污染
对策:
使用新的缓冲液
缓冲液使用前过滤
可能的原因:
操作设备被污染
对策:
保证电泳仪器、印迹仪器和孵育用容器清洁,无外缘污染物
保证在转膜后没有凝胶留在膜上,蛋白可能黏在胶上导致背景