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q 【PCR常见问题解答】扩增保真性差:突变、插入、缺失等(2)

a ●确认保真性低的原因:有时保真性低并非由PCR引起,PCR扩增通常只会导致数量很少的单碱基突变。如果产物测序后,发现有大量的突变,或有明显的插入、缺失等,很可能来自其他实验步骤,如DNA在大肠杆菌中复制时发生重组,或是测序时的污染。这种情况,可以重新挑若干克隆测序,或直接更换所用菌株。
●RT-PCR的保真性:反转录酶保真性通常低于PCR酶。对于RT-PCR,上游反转录步骤的突变几率要大于下游PCR,如有突变,可以重新反转录或选保真性更高的反转录酶。

q 【PCR常见问题解答】扩增保真性差:突变、插入、缺失等(1)

a ●选择高保证酶:B型DNA聚合酶,如Pfu系列酶,具有3`→5`的外切酶活性,能够校正错配的碱基,具有高保真性。另外,复合酶中由于有B型DNA聚合酶的存在,也具有较高的保真性,但保真性比B型DNA聚合酶要低。
●优化PCR体系与条件:适当增加模板量,减少循环数,可以降低突变几率,提高保真性。

q 【PCR常见问题解答】扩增特异性差:引物二聚体、杂带、拖尾等

a ●选择热启动酶:与普通PCR酶相比,热启动酶具有更高的扩增效率与特异性。
●优化反应体系与条件:升高退火温度可以有效提高特异性。另外减少循环数、适当降低Mg2+工作浓度,也可以提高特异性,但都会导致扩增效率的下降,需要根据具体的实验要求优化合适的条件。还可以尝试某些特殊的程序,如巢式PCR,Touch Down PCR等。
●PCR产物需要进行后续实验时,如果确定有目的条带扩增,可以凝胶回收自的条带。

q 【PCR常见问题解答】扩增效率低:条带较弱或无扩展(3)

a 反应体系与条件的原因:增加循环数、降低退火温度、适当升高Mg2+工作浓度,都可以提高扩增效率,但同时会导致特异性与保真性下降,需要根据具体的实验要求优化合适的条件。

q 【PCR常见问题解答】扩增效率低:条带较弱或无扩展(2)

a 模板、引物的原因:确保模板、引物的品质,保证没有降解。另外,如果模板含有较多的抑制物时(如植物基因组模板),推荐使用抗抑制能力强的PCR酶,还可以对模板进行梯度稀释后扩增,摸索合适的模板用量。