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q 【His标签蛋白纯化常见问题解答】目的蛋白不与介质结合?(1)

a ●目的蛋白没有His标签,其原因可能是载体构建有误、表达提前终止(C端融合表达His标签),等等。建议测序检查,或尝试更换表达载体。
●His标签折叠在蛋白质内部,没有暴露。该情况多见于包涵体蛋白在变性条件下的纯化。建议充分变性蛋白,可以尝试使用更强的变性剂(如用6 M盐酸胍代替8 M尿素)、加入助溶剂(SDS)或还原剂(DTT、β-巯基乙醇)等方法。

q 【His标签蛋白纯化常见问题解答】层析柱堵塞?

a 待纯化蛋白样品中存在固体杂质,多见于菌体裂解液直接上样。建议对样品微滤(0.45 μm)处理。

q 【原核蛋白表达常见问题解答】目的蛋白大小不正确?

a ●蛋白的结构对判断分子量大小有一定影响。可以通过加热变性蛋白,从而准确判断蛋白大小。
●确认蛋白表达是否完整,蛋白是否提前终止表达。
●若形成二聚体甚至多聚体,可以通过加热变性蛋白‘打开二硫键(加入DTT、β-ME等还原剂)等手段,破坏次级结构,准确判断分子量大小。

q 【原核蛋白表达常见问题解答】目的蛋白不可溶,形成包涵体?(2)

a ArtMediaTMProtein Expression培养基。

q 【原核蛋白表达常见问题解答】目的蛋白不可溶,形成包涵体?(1)

a 首先确认目的蛋白是否有表达。
●裂解菌体并离心后,通过对全菌、上清、沉淀的检测,确认目的蛋白是否表达,是否形成了包涵体。
●包涵体的形成与蛋白自身结构、表达系统、诱导表达条件等因素有着密切关系。在无法改变蛋白自身结构的情况下,可以尝试不同的表达载体与菌株,增强其溶解能力,优化出适合特定蛋白的表达系统。
●目前认为包涵体的形成是由于蛋白在细胞内积累速度过快,没有正确折叠而聚集沉淀。可以通过优化诱导表达条件,如降低诱导时菌液的OD值等,以减缓蛋白的积累。