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q 【Trans 实验常见问题和解答】PCR--同样模板,和其他公司同类产品相比扩增效果差或者根本没有扩增

a 重新摸索反应条件,调整模板浓度或者退火温度,或者加入GC Enhancer使用;
有一部分情况是酶不可能扩增出所有的基因,正好碰上的是不适合扩增的基因,可尝试其他酶

q 【Trans 实验常见问题和解答】PCR--出现片状拖带或涂抹带

a 可能原因:酶量过多或酶的质量差,dNTP浓度过高,Mg2+浓度过高,退火温度过低,循环次数过多。
对策:①减少酶量,或调换另一来源的酶。②减少dNTP的浓度。③适当降低Mg2+浓度。④增加模板量,减少循环次数。

q 【Trans 实验常见问题和解答】PCR--出现非特异性扩增带

a PCR扩增后出现的条带与预计的大小不一致,或大或小,或者同时出现特异性扩增带与非特异性扩增带。
非特异性条带的出现,其原因:
(1)引物与靶序列不完全互补、或引物聚合形成二聚体。
(2)Mg2+离子浓度过高、退火温度过低,及PCR循环次数过多有关。
(3)酶的质和量,往往一些来源的酶易出现非特异条带而另一来源的酶则不出现,酶量过多有时也会出现非特异性扩增。
对策:①必要时重新设计引物。②减低酶量或调换另一来源的酶。③降低引物量,适当增加模板量,减少循环次数。④适当提高退火温度或采用二温度点法(93℃变性,65℃左右退火与延伸)。⑤降低Mg2+浓度。

q 【Trans 实验常见问题和解答】PCR--假阳性

a 出现的PCR扩增条带与目的靶序列条带一致,有时其条带更整齐,亮度更高。
可能原因:
(1)引物设计不合适:选择的扩增序列与非目的扩增序列有同源性,因而在进行PCR扩增时,扩增出的PCR产物为非目的性的序列。靶序列太短或引物太短,容易出现假阳性。
对策:需重新设计引物。
(2)靶序列或扩增产物的交叉污染:这种污染有两种原因: 一是整个基因组或大片段的交叉污染,导致假阳性。
对策: ①操作时应小心轻柔,防止将靶序列吸入加样枪内或溅出离心管外。 ②除酶及不能耐高温的物质外,所有试剂或器材均应高压消毒。所用离心管及样进枪头等均应一次性使用。 ③必要时,在加标本前,反应管和试剂用紫外线照射,以破坏存在的核酸。 二是空气中的小片段核酸污染,这些小片段比靶序列短,但有一定的同源性。可互相拼接,与引物互补后,可扩增出PCR产物,而导致假阳性的产生。
对策:可用巢式PCR方法来减轻或消除。

q 【Trans 实验常见问题和解答】PCR--假阴性(2)

a (5)引物:引物质量、引物的浓度、两条引物的浓度是否对称,是PCR失败或扩增条带不理想、容易弥散的常见原因。有些批号的引物合成质量有问题,两条引物一条浓度高,一条浓度低,造成低效率的不对称扩增。
对策: ① 选定一个好的引物合成单位; ② 引物的浓度不仅要看OD值,更要注重引物原液做琼脂糖凝胶电泳,一定要有引物条带出现,而且两引物带的亮度应大体一致,如一条引物有条带,一条引物无条带,此时做PCR有可能失败,应和引物合成单位协商解决。如一条引物亮度高,一条亮度低,在稀释引物时要平衡其浓度; ③ 引物应高浓度小量分装保存,防止多次冻融或长期放冰箱冷藏部分,导致引物变质降解失效; ④引物设计不合理,如引物长度不够引物之间形成二聚体等,需重新设计引物。
(6)Mg2+浓度:Mg2+离子浓度对PCR扩增效率影响很大,浓度过高可降低PCR扩增的特异性,浓度过低则影响PCR扩增产量甚至使PCR扩增失败而不出扩增条带。 对策:调整Mg2+浓度,从1mM到3mM,间隔0.5mM进行一系列反应,确定对于每个模板和引物对的最佳镁离子浓度。
注意:对实时定量PCR,使用3mM到5mM的镁离子浓度。
(7)反应体积的改变。
对策:通常进行PCR扩增采用的体积为20ul、30ul、50ul,或100ul,应用多大体积进行PCR扩增,是根据科研和临床检测不同目的而设定,在做小体积如20ul后,再做大体积时,一定要摸索条件,否则容易失败。