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q 【Trans 实验常见问题和解答】QPCR--无CT值(信号)出现

a 可能原因:
(1)反应循环数不够
对策:35个循环以上,可根据实验情况增加循环(如至45cycles),但高于45个循环会增加过多的背景信号。
(2)测荧光信号的步骤有误
对策:一般SG法采用72℃延伸时采集,Taqman法则一般在退火结束时或延伸结束采集信号。
(3)引物或探针降解
对策:可通过PAGE电泳检测其完整性。
(4)引物或探针的设计
如探针高于引物的温度不够,造成探针未杂交上而产物已延伸的情况。
对策:重新设计引物或探针
(5)模板量不足
对策:对未知浓度的样品应从系列稀释样本的最高浓度做起。
(6)模板降解
对策:避免样品制备中杂质的引入及反复冻融的情况。

q 【Trans 实验常见问题和解答】RT--扩增产物滞留在加样孔中

a 可能原因:由于模板量过高而导致PCR结果产生了高分子量的DNA胶状物。
对策:将第一链结果至少稀释100倍再进行二次扩增。另外,在二次PCR时使用的退火温度如果比引物的Tm值低5℃,可以将退火温度适当增高或进行热启动以提高特异性。

q 【Trans 实验常见问题和解答】RT--在无反转录酶的情况下,对照RNA获得扩增结果

a 可能原因:
(1)对照RNA中含有痕量DNA。
对策:第一链cDNA稀释1:10、1:100、1:1000倍以消除DNA污染所造成的影响。
(2)有可能是引物二聚体的条带。

q 【Trans 实验常见问题和解答】RT--污染造成假阳性

a 可能原因:
(1)样品间的交叉污染
对策:① 收集样品的容器最好使用一次性的,如重复使用,应在使用前应于180℃的高温下干烤6小时或更长时间; ② 样品存放时要密封严实,以防外溢造成相互间的交叉污染; ③ 样品在提取过程中离心管及吸样枪头最好使用一次性的,以免不同实验样品间相互污染; ④ 由于吸样枪污染会导致样品间的污染,也是一个值得注意的问题,由于操作不慎将样品或提取物吸入枪内或粘上枪头是一个严重的污染源,因而加样或吸取时要十分小心,吸时要慢,吸取尽量一次性完成,忌多次抽吸,以免交叉污染或产生气溶胶污染; ⑤同时要注意操作时不要剧烈地摇动反应管,开盖时也容易造成气溶胶污染。每次实验完毕都要及时清理实验台面,用0.5%次氯酸钠消毒后再打开紫外灯照射半小时。
(2)RT-PCR本身使用的试剂污染在试剂配制过程中,由于加样枪、容器及其它溶液被污染。
对策:所有试剂都应尽量小量分装,以减少重复加样次数,避免污染机会,另外RT-PCR试剂应尽可能密封好分类存放。每次操作完毕后同样要进行台面消毒和紫外线照射消毒。
(3)扩增产物的污染,极微量的扩增产物污染就可造成假阳性。
对策;每次实验完后,扩增产物都要及时密封后处理。设阳性对照。
(4)操作人员污染:只要存在少量的RNA酶就会引起RNA的降解,从而影响结果的准确性,RNA酶可存在操作人员手汗、唾液中,也可灰尘中,一旦器械、玻璃制品、塑料制品受到污染,容易造成实验失败。
对策:操作人员应戴一次性口罩、帽子、手套,实验过程中手套要勤换。设置PCR操作专用实验室,所用实验用具应为专用,并合理分隔实验室,将样品的提取、配制RT-PCR反应液、PCR循环扩增等步骤分室进行,实验前应将实验室及实验人员工作服用紫外线或臭氧消毒以破坏残留的DNA或RNA。

q 【Trans 实验常见问题和解答】RT--在琼脂糖凝胶分析中看到少量或没有RT-PCR产物

a 可能原因:
(1)RNA被降解
对策:①在用来验证完整性之前先在变性胶上分析RNA,使用良好的无污染技术分离RNA;②在将组织从动物体取出后立刻处理在100%甲酰胺中储存RNA;③如果使用RNase抑制剂,不要加热超过45℃或pH超过8.0,否则抑制剂或释放所有结合的RNase。而且,在≥0.8mM DTT时加入RNase抑制剂,一定要存在DTT。
(2)RNA中包含逆转录抑制剂
对策:通过乙醇沉淀RNA除去抑制剂。用70%(v/v)乙醇对RNA沉淀进行清洗。(逆转录抑制剂包括:SDS,EDTA,甘油,焦磷酸钠,spermidine,甲酰胺和胍盐。)将对照RNA同样品混合,同对照RNA反应比较产量以检验抑制剂。
(3)多糖同RNA共沉淀
对策:使用氯化锂沉淀RNA以除去多糖。
(4)用于合成cDNA第一链合成的引物没有很好退火
对策:①确定退火温度以适合引物。对于随机六聚体,建议在反应温度保温之前先在25℃保温10分钟。②对于基因特异性引物(GSP),可以试一下其他GSP,或换用oligo(dT)或随机六聚体。③确定GSP是反义序列。
(5)起始RNA量不够
对策:增加RNA量。对于<50ng的RNA样品,可以在第一链cDNA合成中使用0.1μg到0.5μg乙酰BSA。
(6)RNA模板二级结构太多
对策:①将RNA和引物在不含盐及缓冲液条件下变性/退火。②提高逆转录反应温度,对TransScriptⅡ可以到55℃,③如果不需要全长cDNA,在第一链反应中使用随机引物。
(7)引物或模板对残余的RNA模板敏感
对策:在PCR前用RNaseH处理。
(8)靶序列在分析的组织中不表达
对策:尝试其他靶序列或组织
(9)PCR没有起作用
对策:对两步法RT-PCR,不要在PCR步骤中使用超过1/5的逆转录反应产物。