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q 【Trans 实验常见问题和解答】QPCR--扩增效率低

a 可能原因:
(1)反应试剂中部分成分特别是荧光染料降解。
(2)反应条件不够优化。
对策:可适当降低退火温度或改为三步扩增法。
(3)反应体系中有PCR反应抑制物
对策:一般是加入模板时所引入,应先把模板适度稀释,再加入反应体系中,减少抑制物的影响。

q 【Trans 实验常见问题和解答】QPCR--熔解曲线不止一个主峰

a 可能原因:
(1)引物设计不够优化
对策:应避免引物二聚体和发夹结构的出现。
(2)引物浓度不佳
对策:适当降低引物的浓度,并注意上下游引物的浓度配比。
(3)镁离子浓度过高
对策:适当降低镁离子浓度,或选择更合适的mix试剂盒。
(4)模板有基因组的污染
对策:RNA提取过程中避免 DNA的引入,或通过引物设计避免非特异扩增。

q 【Trans 实验常见问题和解答】QPCR--阴性对照也出现明显的起峰

a 可能原因:
(1)混合物或水被污染
对策:避免污染。
(2)引物二聚体的出现
对策:用SG法在35cycles以后阴性出现起飞属正常情况,可配合熔解曲线进行分析。
(3)反应过程中探针的降解
对策:用PAGE电泳对探针进行检测。
(4)如果使用了ROX校正,则可能是ROX的降解所造成。

q 【Trans 实验常见问题和解答】QPCR--标准曲线的线性关系不佳

a 可能原因:
加样存在误差,使得标准品不呈梯度
对策:精确操作。
标准品出现降解
对策:避免标准品反复冻融,或重新制备并稀释标准品。
引物或探针不佳
对策:重新设计更好的引物和探针
模板中存在抑制物,或模板浓度过高
对策:降低模板浓度或重新制备。

q 【Trans 实验常见问题和解答】QPCR--CT值出现过晚

a 可能原因:
(1)扩增效率低,反应条件不够优化
对策:设计更好的引物或探针;改用三步法进行反应;适当降低退火温度;增加镁离子浓度等。
(2)PCR各种反应成分的降解或加样量的不足
对策:保证加样准确,及时校正加样器。
(3)PCR产物太长
对策:一般采用80-150bp的产物长度。