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q 【Trans 实验常见问题和解答】QPCR--在哪一步骤采集信号

a SYBRGreenI应当在72°C,此时绝大部分的DNA是双链状态,如上所述,双标记探针通常是两步检测,因此信号采集应该在退火延伸的整合步骤。对于FRET检测,数据应该在退火步骤检测。如果对于信号采集点不确定,可以多点采集作对比。如果监控屏幕检测不到信号,检查程序设定是否存在至少一个的信号采集点。

q 【Trans 实验常见问题和解答】QPCR--退火温度和时间是否合适

a 检查引物和探针的Tm值,SYBRGreenI的退火时间大约20到35秒,双标记探针通常是两步法,退火和延伸合并为一步,时间大约是45到60秒,温度通常在60°C,对于FRET探针退火步骤大约20到30秒。

q 【Trans 实验常见问题和解答】QPCR--变性时间是否合适

a 15到20秒对于变性扩增子是足够了,然而,长一点的产物,可能会需要30秒,60秒的变性时间通常是不需要的。

q 【Trans 实验常见问题和解答】QPCR--变性温度是否合适

a 大部分的双链DNA在95°C就开始解链了,在有些情况下在90至94°C都不能很好地变性DNA。由于部分变性,参加反应的探针和引物相应的减少了,因此反应效率会下降。

q 【Trans 实验常见问题和解答】QPCR--实验重复性不好

a 可能原因: (1)加样不准确。
对策:精确操作。
(2)仪器在样品上温度条件有差异,即温度均一性不好。
(3)模板浓度低。样品初始浓度越低,重复性越差。
对策:应减少样品的稀释倍数。