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q 【Trans 实验常见问题和解答】DNA电泳--DNA带缺失

a 1) 小DNA带走出凝胶:缩短电泳时间,降低电压,增强凝胶浓度;
2) 分子大小相近的DNA带不易分辨:增加电泳时间,核准正确的凝胶浓度;
3) DNA 变性:电泳前请勿高温加热DNA链,以20mM NaCl Buffer稀释DNA;
4) DNA链巨大,常规凝胶电泳不合适:在脉冲凝胶电泳上分析。

q 【Trans 实验常见问题和解答】DNA电泳--带弱或无DNA带

a 1) DNA的上样量不够:增加DNA的上样量;聚丙烯酰胺凝胶电泳比琼脂糖电泳灵敏度稍高,上样量可适当降低;
2) DNA降解:避免DNA的核酸酶污染;
3) DNA走出凝胶:缩短电泳时间,降低电压,增强凝胶浓度;
4) 对于EB染色的DNA,所用光源不合适:应用短波长(254nm)的紫外光源。

q 【Trans 实验常见问题和解答】DNA电泳--不规则DNA带迁移

a 1) 对于λ/Hind III片段cos位点复性
电泳前于65℃加热DNA 5分钟,然后在冰上冷却5分钟;
2) 电泳条件不合适:
电泳电压不超过20V/cm;温度<30℃;经常更换电泳缓冲液;
3) DNA变性:
以20mM NaCl Buffer稀释DNA,电泳前勿加热。

q 【Trans 实验常见问题和解答】DNA电泳--DNA带模糊

a 可能原因
DNA降解:
避免核酸酶污染;
电泳缓冲液陈旧:
电泳缓冲液多次使用后,离子强度降低,pH值上升,缓冲能力减弱,从而影响电泳效果。建议经常更换电泳缓冲液;
所用电泳条件不合适:
电泳时电压不应超过20V/cm,温度<30℃;巨大DNA链电泳,温度应<15℃;核查所用电泳缓冲液是否有足够的缓冲能力;
DNA上样量过多:
减少凝胶中DNA上样量;
DNA样含盐过高:
电泳前通过乙醇沉淀去除过多的盐;
有蛋白污染:
电泳前酚抽提去除蛋白;
DNA变性:
电泳前勿加热,用20mM NaCl缓冲液稀释DNA。

q 【Trans 实验常见问题和解答】QPCR--是否选定了合适的增益值

a 一些情况下会看到曲线超过了窗口范围,在荧光强度100的地方成一直线。尽管大部分的数据可以用,但是减少增益,一些原始数据就不会超出范围。有时,在第一个循环信号就跳出了窗口范围,这是由于增益选得太高,看起来像没有检测到数据。如果熔解曲线分析时,开始荧光就达到了100,则应当用低的增益重新运行,而不需要重新运行扩增反应,SYBRGreenI和FRET的样品可以在一定程度上反复使用。