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q 【Trans 实验常见问题和解答】载体构建--Simple载体

a 插入位点距离M13引物距离过短,可能会造成测序结果部分不准;

q 【Trans 实验常见问题和解答】载体构建--克隆数少

a 如和T4载体相比克隆数量少则是TOPO载体本身的弱势,但如果只长几个则是操作问题,可能的原因有:
连接体系不合适,片段浓度过大或者过小,建议连接前粗略定量;
连接时间太短:胶回收产物或者毒基因建议延长连接时间;
转化操作问题:细胞化冻时间过长,热激时间过长,复苏时间短,培养基营养成分不够;
感受态细胞本身效率不高

q 【Trans 实验常见问题和解答】载体构建--做蓝白斑筛选时,只见蓝斑,不见白斑

a 对策:
(1)做空白对照,将没有进行重组的宿主菌直接接入含有IPTG和X-gal LB琼脂糖平板在37℃下培养17小时以上以便显色。显色后将平板置于4℃两小时,蓝色会加深。观察对照的蓝色是否和实验组的颜色一样,如果实验组的蓝色较浅,可能载体带有插入片段,但没有阻断lacZ阅读框。
(2)用牙签挑取浅蓝色菌落,进行PCR扩增,同时设立阳性、阴性和空白对照。阳性对照为经测序确认含有相同大小插入片段的重组菌落,阴性对照为经测序确认为不含插入片段的空载质粒菌落,空白对照为不加模板的PCR体系。PCR扩增产物通过非变性PAGE条带分析,确定是否重组,即PCR扩增后的反应液中加入2μl的6×上样缓冲液,混匀,上样至已预电泳的10%非变性PAGE加样孔中,200V电压电泳后,取胶至EB液中染色30min,最后在紫外灯下数码照相。比对结果,判断浅蓝色菌落是否为重组子。

q 【Trans 实验常见问题和解答】载体构建--做蓝白斑筛选,只见白斑,不见蓝斑

a 对策:
(1)做空白对照,将没有进行重组的宿主菌直接接入含有IPTG和X-gal LB琼脂糖平板在37℃下培养17小时以上以便显色。显色后将平板置于4℃两小时,蓝色会加深。如果正常显色,说明试剂,培养基及菌没有问题,如果不能正常显色,更换试剂重新配置培养基或者接入新的菌种,再次培养,确保空白对照结果正确。
(2)若空白试验结果正确,用牙签挑取白色菌落,进行PCR扩增,同时设立阳性、阴性和空白对照。阳性对照为经测序确认含有相同大小插入片段的重组菌落,阴性对照为经测序确认为不含插入片段的空载质粒菌落,空白对照为不加模板的PCR体系。PCR扩增产物通过非变性PAGE条带分析,确定是否重组,即PCR扩增后的反应液中加入2μl的6×上样缓冲液,混匀,上样至已预电泳的10%非变性PAGE加样孔中,200V电压电泳后,取胶至EB液中染色30min,最后在紫外灯下数码照相。比对结果,判断白斑是否为重组子。

q 【Trans 实验常见问题和解答】胶回收--能否使用去离子水洗脱回收?

a 可以,但是实验室所用去离子水一般PH值偏低,可用NaOH适当调高PH值>7.0,以增加回收得率。