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q 【Trans 实验常见问题和解答】载体构建--内切酶保存期内快速失活

a 可能原因:
(1)保存温度不合适
对策:内切酶贮藏在含50%甘油的贮藏液中,应在-20℃低温保存。
(2)以稀释形式保存
对策:稀释酶液不宜长期存放,应一次使用。
(3)贮藏缓冲液不适当
对策:使用厂家推荐的贮藏缓冲液。
(4)低蛋白浓度
对策:内切酶与500ug/ml的BSA一起保存。

q 【Trans 实验常见问题和解答】载体构建--酶切后没有观察到DNA片段的存在

a 可能原因: (1)DNA定量错误(如RNA含量较高)
对策:用RNA酶A(无DNA酶)100ug/ml消化DNA样,酚抽提后沉淀溶解,定量。
(2)在酶切反应液中形成非特异性的沉淀
对策:在反应前透析DNA样品或用酒精沉淀二次。

q 【Trans 实验常见问题和解答】载体构建--DNA片段数目多于理论值

a 可能原因:
(1)内切酶星状活性
对策:检查反应条件:甘油浓度大于12%,盐度过低,Mn2+的存在及酶:DNA值过大均可导致星状活性,降低酶的使用量。
(2)其它内切酶污染
对策:用λDNA作底物检查酶切结果。
(3)底物中含其它DNA杂质
对策:电泳检查DNA,换用其它酶切,纯化DNA片段。

q 【Trans 实验常见问题和解答】载体构建--DNA酶切不完全

a 可能原因:
内切酶活性下降
对策:用5-10倍过量消化。
内切酶稀释不正确
对策:用酶贮藏液或反应缓冲液稀释酶。
DNA不纯,反应条件不佳
对策:将DNA过柱纯化,乙醇沉淀DNA;检查反应系统是否最佳。
内切酶识别的DNA位点上的碱基被甲基化或存在其它修饰
对策:换用对DNA甲基化不敏感的同裂酶,重新将质粒DNA转化至dcm-,dam-基因型的细菌菌株;将DNA底物与λDAN混匀进行切割验证。
部分DNA溶液粘在管壁上
对策:反应前离心数秒。
内切酶溶液粘度大,取样不准
对策:将内切酶稀释,增大取样体积。
酶切后DNA粘末端退火
对策:电泳前将样品置65℃保温5-10分钟,取出后置冰浴骤冷.
由于反应溶液、温度、强烈振荡使内切酶变性
对策:使用标准反应缓冲液及温度,避免强烈振荡。
过度稀释使酶活性降低
对策:适当稀释酶液,反应液稀释的酶不能贮藏。
反应条件不适
对策:使用最佳反应体系。
识别位点两侧插入了可影响酶切效率的核酸顺序
对策:加大酶量5-10倍。

q 【Trans 实验常见问题和解答】载体构建--DNA完全没有被内切酶切割

a 可能原因:
内切酶失活
对策:标准底物检测酶活性。
DNA不纯,含SDS、酚、EDTA等内切酶抑制因子。
对策:将DNA过柱纯化,乙醇沉淀DNA
条件不适(试剂、温度)
对策:检查反应系统是否最佳。
DNA酶切位点上的碱基被甲基化
对策:换用对DNA甲基化不敏感的同裂酶,重新将质粒DNA转化至dcm-,dam-基因型的细菌菌株。
DNA位点上存在其它修饰
对策:将DNA底物与λDAN混匀进行切割验证。
DNA不存在该酶识别顺序
对策:换用其它的酶切割DNA或过量酶消化进行验证。