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q 【Trans 实验常见问题和解答】载体构建--用T4 DNA连接酶连接后转化失败

a 可能原因:
(1)反应体系内无ATP或Mg2+
对策:使用随酶提供的buffer或向其它兼容的buffer中加入ATP。含ATP的Buffer保存超过1年,其内ATP可能会降解,导致连接失败。当补加ATP时,确定补加的是核糖核酸ATP,而不是脱氧核糖核酸ATP,因为后者不起作用。
(2)反应体系中盐浓度过高或EDTA含量高
对策:纯化DNA
(3)去磷酸化步骤完成后,CIP、BAP或SAP失活不彻底
对策:根据厂家推荐的方法去除去磷酸化酶。
(4)DNA浓度过高导致连接后产生的均是线性DNA
对策:保持总DNA浓度在1-10μg/ml之间。
(5)连接末端为单碱基突出末端
对策:使用最高至5μl高浓度连接酶16°C过夜连接。
(6)插入片段和质粒没有磷酸化。
注重:假如载体已经去磷酸化了,而引物又没有磷酸化会导致连接失败,订购磷酸化的引物或对引物进行磷酸化。
(7)加入过多的连接混合物至感受态细胞
对策:50μl感受态细胞应加入1-5μl连接混合物。
(8)插入片段太大,不能进行环化
对策:降低插入片段的浓度,并使用高浓度连接酶16°C过夜连接。
(9)连接酶失活
对策:用lambda HindIII或其它可行的底物进行检测。

q 【Trans 实验常见问题和解答】载体构建--平端连接注意事项

a (1)插入片断和载体片断的比例要高。
(2)连接酶要加的多点,最好用高浓度的酶。
(3)载体片断要做去磷酸化处理。
(4)可以用15%的PEG8000来增加连接效率和减少载体自联。
(5)反应体系10ul,不要太大。
(6)去磷酸化的步骤要根据自己酶的性质而定,一般要反应一个小时,在反应半小时后再补充酶再反应半小时。
(7)插入片断和载体片断要酶切良好。
(8)低温下长时间的连接效率比室温下短时间连接的好,平端连接需要过夜反应。建议放在四度冰箱连接两天效率更高比14度好。

q 【Trans 实验常见问题和解答】载体构建--粘端连接注意事项

a (1)连接反应的温度:DNA连接酶的最适反应温度为37℃,但在此温度下,粘性末端的氢键结合很不稳定,折衷方法是12℃过夜。
(2)DNA的平未端和粘性末端:由于内切酶产生的DNA末端有平未端和粘性末端,因而连接反应中就有平未端连接和粘性末端连接。二者连接效率不同。粘性末端效率高,因而在底物浓度,酶浓度选择上是有差异的。
(3)碱性磷酸酶处理质粒载体:为了提高连接效率,一般采取提高DNA的浓度,增加重组子比例。这样就会出现DNA自生连接问题,为此通常选择对质粒载体用碱性磷酸酶处理,除去其5’末端的磷酸基,防止环化,通过接反应后形成的缺口可在转化细胞后得以修复。
(4)连接反应的检测:连接反应成功与否,最后的检测要通过下一步实验,转化宿主菌, 阳性克隆的筛选来确定。
(5)如果要检验连接酶和连接酶专用的缓冲液是否有效,可重新连接酶切后的λDNA。若连接成功,则说明有效。

q 【Trans 实验常见问题和解答】载体构建--酶切后的DNA片段连接效率低

a 可能原因:
含磷酸盐的浓度高
对策:透析,乙醇沉淀去除磷酸盐
内切酶失活不全或含有ATP酶
对策:延长灭活时间或用酚抽提,乙醇沉淀回收DNA。
平末端连接
对策:加大T4 DNA连接酶的用量。
外切酶污染
对策:减少酶用量,缩短保温时间,酚抽提回收DNA。
连接缓冲液不合适
对策:重新配制连接缓冲液。

q 【Trans 实验常见问题和解答】载体构建--电泳后DNA片段的带型弥散,不均一

a 可能原因:
(1)DNA上结合有蛋白质
对策:电泳前上样液65℃加热5min,并加入0.1%的SDS,酚/氯仿抽提纯化。
(2)内切酶中含有DNA外切酶
对策:减少酶用量或消化时间,换用新包装的酶。