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q 【Trans 实验常见问题和解答】感受态细胞--影响感受态细胞转化效率的因素及实际操作过程中应注意的事项有哪些?

a 1)细菌的生长状态:实验中应密切注视细菌的生长状态和密度,尽量使用对数生长期的细胞(一般通过检测OD600来控制。DH5α菌株OD600为0.5时细胞密度是5×107/ml);
2)所有操作均应在无菌条件和冰上进行;
3)经CaCl2处理的细胞,在低温条件下,一定的时间内转化率随时间的推移而增加,24小时达到最高,之后转化率再下降(这是由于总的活菌数随时间延长而减少造成的);
4)化合物及无机离子的影响:在Ca2+的基础上联合其他二价金属离子(如Mn2+或 Co2+)、DMSO或还原剂等物质处理细菌,可使转化效率大大提高(100-1000倍);
5)所使用的器皿必须干净。少量的去污剂或其它化学物质的存在可能大大降低细菌的转化效率;
6)质粒的大小及构型的影响:用于转化的应主要是超螺旋的DNA;
7)一定范围内,转化效率与外源DNA的浓度呈正比。

q 【Trans 实验常见问题和解答】感受态细胞--生长速度慢,菌落小

a 平板生长时间一般为14小时,有的老师期望值过高;
生长时间超过20小时菌落仍然很小则可能是培养基质量问题或者基因有毒性抑制细菌生长;
复苏时间过短,延长复苏时间可提高菌落在平板上的生长速度

q 【Trans 实验常见问题和解答】感受态细胞--杂菌或微卫星菌落

a 抗生素有效浓度下降:包括配制平板时培养基温度过高、抗生素母液配制时间过长、平板配制时间过长;
操作过程中污染,没有在工作台上操作;
所用器材、试剂等污染

q 【Trans 实验常见问题和解答】感受态细胞--效率低

a 检查到老师手中时是否有干冰,确保运输条件;
保证细胞-80度保存;
连接失败或效率低;
较大质粒或者重组产物转化困难,需要特定细胞,如Trans2-Blue;
冰上化冻时间不能太长;
复苏时间不能太短;
涂板时可离心后全涂;
建议用对照质粒检测细胞效率

q 【Trans 实验常见问题和解答】载体构建--内切酶酶切反应后,有什么因素可以导致T4 DNA连接酶连接和后续的转化失败

a 可能原因:
(1)内切酶酶切不充分
对策:假如酶切位点位于PCR产物的末端,识别位点末端侧需要加至少6个保护碱基。用对照底物检测内切酶的活性。
(2)内切酶没有完全失活
对策:假如内切酶不能热失活,用酚/氯仿抽提纯化DNA。
(3)内切酶的星号活性消化了载体或插入片段
对策:跑胶检测DNA,假如存在多余的条带,减少内切酶使用量或减短反应时间。
(4)DNA或内切酶有外切酶或磷酸酶的污染,破坏了DNA末端
对策:酚/氯仿抽提纯化DNA。检查内切酶的质量检测资料和注重事项,假如连接QC不佳或外切酶活性高,减少内切酶量或縮短反应时间。