产品FAQ
首页 > 服务与支持 > 产品FAQ

q 【Trans 实验常见问题和解答】点突变--没有扩增

a 引物设计是否合理;
调整模板量和退火温度

q 【Trans 实验常见问题和解答】点突变--测序没有突变体

a 送测序只送一个没有突变体的话建议多送几个;
保证扩增效率的前提下使用尽可能少的模板量;
DMT酶消化时可少消化点PCR产物 。

q 【Trans 实验常见问题和解答】感受态细胞--转化的大肠杆菌为什么不长?

a 1)检查感受态细胞是否有问题,不管公司的也好自己做的也好,转化连接产物时同时转化一只质粒,作为对照。
2)连接T的时候,保证连接比例没有问题。连接时间可以适当延长,但是试剂盒的连接往往效率很高,连接时间不是大问题。
3)转化的细节处理:加培养基复苏:摇1 h的话,可以多加入一些培养基,此时培养基一定不要加入抗性!摇1 h复苏,摇速在150rpm先摇30min。
4) 涂板时来回轻轻涂布,感觉大多数地方都涂到即可,不要反复用力涂布,不要把涂布环或者涂布棒烧的过热,或者不待冷却就涂。切记感受态细胞比较娇嫩。
5)检查一下琼脂板是否有问题。
6)检查一下抗生素在配置过程中是否出错,有没有加错。

q 【Trans 实验常见问题和解答】感受态细胞--工程菌的不稳定性及其对策

a 工程菌稳定与否,与重组质粒本身的分子组成、宿主细胞生理和遗传性及环境条件等因素有关。
就质粒本身的分子结构而言,引起工程菌不稳定常常是由于稳定区受到影响。另外可能由于重组质粒上有重复序列,或与宿主染色体有部分同源等都会造成质粒的不稳定。
就宿主而言,除了上述质粒中有同源序列外,还与宿主的比生长速率、宿主中重组基因(rec系统)的完整性、重组时有关基因的具体变异等都有关系。
在培养环境中高温、去垢剂(如SDS等)、某些药物(如利福平)、染料及胸腺嘧啶饥饿、紫外线辐射等都会引起质粒的丢失,因而常采取下列措施以防止或降低工程菌的不稳定性。
(1)组建合适载体 在质粒构建时,插入一段特殊的DNA片段或基因以使宿主细胞分裂时,质粒能够较稳定地遗传到子代细胞中。
(2)选择适当宿主 重组质粒的稳定性在很大程度上受宿主细胞遗传特性的影响,在选择宿主时,必须确定其遗传特点。相对而言重组质粒在大肠杆菌中比较稳定,而在枯草杆菌和酵母中较不稳定。
(3)施加选择压力 从遗传学来说,选择即利用某些生长条件使得只有那些具有一定遗传特性的细胞才能生长。在重组DNA技术中,有好几方面利用选择压力,如转化后用选择压力确定含有重组质粒的克隆株,而在利用克隆菌进行发酵生产时,经常采取施加选择压力的方法消除重组质粒的不稳定,以提高菌体纯度和发酵生产率。①抗生素添加法②抗生素依赖变异法③营养缺陷法。
(4)控制基因过量表达 提高质粒稳定性的目的是为了提高克隆菌的发酵生产率,但许多研究发现,外源基因表达水平越高,重组质粒往往越不稳定,因此可采取分段培养法,即前期控制基因过量表达,使重组质粒稳定遗传,到后期通过提高质粒的拷贝、转录、翻译效率使外源基因高效表达。①利用阻遏—去阻遏启动子原理控制基因过量表达,②选择温度敏感型质粒控制基因过量表达。
(5)控制培养条件 重组菌所处的培养环境条件对其质粒的稳定性和表达效率等均具有很大的影响,当重组菌构建成功后,能否进入工业化生产阶段,其关键的步骤就是筛选最适的培养条件,包括培养基配方、培养温度、pH值范围,溶氧水平(好氧菌),添加选择压力和控制基因表达,实质也是通过培养条件的控制实现的。影响培养条件的因素很多,能影响菌体生长的所有培养工艺、工程参数都会影响质粒的稳定性,在这些工艺工程参数中,培养基成分、培养温度、菌体的比生长速率三个方面最为重要。

q 【Trans 实验常见问题和解答】感受态细胞--用氨苄抗性的选择培养基筛选转化细胞时,平板上没有克隆,有一层白色的浆状物,不均匀,像一层菌膜。

a 可能原因:氨苄无效或浓度过低,操作中引入杂菌;质粒没有转进去。
对策:重新转化质粒,更换氨苄。