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q 【Trans 实验常见问题和解答】质粒提取--在琼脂糖凝胶上点样时,为什么质粒漂出点样孔?

a 乙醇没有完全从柱子上去除。洗涤液2洗涤后应离心并静置数分钟尽量去除残 留乙醇后,再加入洗脱液洗脱回收。

q 【Trans 实验常见问题和解答】质粒提取--试剂盒提取质粒纯度不高,如何解决?

a 1) 有蛋白质污染
应在加入去蛋白液后,以足够高的转速离心,使沉淀紧密,并小心地吸取上清液,避免吸入沉淀。另外,不要使用过多菌体。经悬浮液、裂解液、中和液处理,离心后溶液应为澄清的,如果还混有微小蛋白悬浮物可再次离心去除后再进行下一步骤。
2) 有RNA污染
说明RNaseA处理不彻底,请减少菌体用量或加入悬浮液之后,振荡充分混匀室温放置一段时间。如果悬浮液已保存6个月以上,请在悬浮液中添加RNaseA至终浓度100μg/ml。
3) 混有基因组DNA
加入裂解液、中和液后应温和混匀,如果剧烈振荡,可能会导致基因组DNA断裂成小碎片从而混杂在质粒中。如果加入裂解液后过于黏稠,无法温和混匀,请减少菌体用量。另细菌培养时间过长会导致细胞和DNA的降解,培养时间不要超过16小时。
4) 裂解液加入时间过长
裂解液加入溶液后,放置时间不宜太长,否则有可能会产生小片段DNA污染。
5) 含大量核酸酶的宿主菌
宿主菌含大量核酸酶,在质粒提取过程中降解质粒DNA,影响提取质粒DNA的完整性,最好选用不含核酸酶的大肠杆菌宿主菌,如DH5а和Top10。
6)质粒的二聚体和多聚体形式
质粒复制过程中形成的,与宿主菌相关,电泳可检测出多条条带,单酶切处理后可变成单一条带。

q 【Trans 实验常见问题和解答】质粒提取--用试剂盒未提出质粒或质粒得率低有哪些原因?

a 1) 细菌老化
请凃布平板培养后,重新挑选新菌落进行液体培养。
2) 细菌培养物生长过度或不新鲜
不要于37℃培养超过16小时,分离质粒前长时间存放培养物是不利的。
3) 质粒拷贝数低
由于使用低拷贝数载体引起的质粒DNA提取量低,可更换具有相同功能的高拷贝数载体。
4) 菌体中无质粒
有些菌体本身不能在某些菌种中稳定存在,经多次转接后有可能造成质粒丢失。例如柯斯质粒在大肠杆菌中长期保存不稳定,因此不要频繁转接,每次接种时应该接种单菌落。另外检查筛选用抗生素使用浓度是否正确。
5) 菌体过量,碱裂解不充分
取样时菌液过多,导致菌体裂解不充分,可减少菌体用量或增加溶液悬浮液、裂解液、中和液的用量。对低拷贝数质粒,提取时可加大菌体用量并加倍增加溶液悬浮液、裂解液、中和液的用量(应保持1:1:1.4比例)。
6) 溶液使用不当
溶液裂解液、中和液在温度较低时容易出现盐析,如出现,应将其放入37℃水浴至完全溶解、澄清,方可使用。
7) 质粒未全部溶解(尤其质粒较大时)
洗脱溶解质粒时,可适当加温或延长溶解时间。
8) 乙醇残留
洗涤液Ⅱ洗涤后应离心并静置数分钟尽量去除残留乙醇后,再加入洗脱液洗脱回收。
9) 洗脱液加入位置不正确
洗脱液应加入吸附柱中膜的中央以确保洗脱液完全覆盖吸附膜的表面达到最大洗脱效率。
10) 洗脱效率:
洗脱效率与洗脱液PH值、洗脱液用量、洗脱次数、加入洗脱液后的静置时间和是否预热等因素有关。PH7.0-8.5之间,洗脱液用量不得小于50μl,重复洗脱2-3次,增加室温静置时间及65℃水浴预热可以有效提高得率30%。

q 【Trans 实验常见问题和解答】点突变--测序发现在非突变点有突变

a 选择其他克隆测序;
减少循环数

q 【Trans 实验常见问题和解答】点突变--转化不长克隆

a 纯化酶消化产物;
PCR扩增效果不好影响克隆,重新摸索PCR条件