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q 【Trans 实验常见问题和解答】RNA提取 -- RNA降解

a 1)新鲜细胞:如果试剂没有问题,且外源性污染也可以排除,那么降解几乎都来自裂解液的用量不足。如果将裂解液直接加入培养皿中裂解细胞,一定要使裂解液能覆盖住细胞。
2)新鲜组织:某些富含内源核酸酶的样品(如肝脏,胸腺等),即使使用电动匀浆器匀浆也不能避免RNA的降解。更可靠的方法是:在液氮条件下将组织研碎,并且匀浆时使用更多裂解液。
3)冷冻样品:样品取材后应立即置于液氮中速冻,然后移至-70℃冰箱保存。样品决不能未经液氮速冻而直接保存于-70℃冰箱中。冷冻样品,即使是冷冻细胞, 如果不在液氮条件下研磨碎,而直接加入裂解液中匀浆,RNA也比新鲜样品更容易降解。样品在与裂解液充分接触前决不能出现融化,所以研磨用具必须预冷,在 碾磨过程中要及时补充液氮。样品研碎后,在液氮刚刚挥发完时,将样品迅速转移到含裂解液的容器中,立即混匀匀浆。
4)外源RNA酶的污染:试剂,器械及实验环境中的RNA酶进入实验系统。
5)内源RNA酶的污染:抑制剂失效或者用量不够,实验样品过多;匀浆时 温度过高。

q 【Trans 实验常见问题和解答】质粒提取--加入溶液II后,菌液仍然呈浑浊状态,或者混浊度没有明显 的改变?

a 1)问题可能是发生在溶液II上。首先看看10%SDS是否是澄清的?NaOH是否是有效的?如果使用的是试剂盒,也要首先确认溶液II是否澄清没有沉淀?
2)可能是细菌浓度很高,适当调整增加溶液I/II/III的体积。
3)可能是“杂菌”污染,如果菌液生长异常快,就有可能被杂菌污染。这种情况一般表现为和目的菌有相同的抗性,生长速度异常,能够提出质粒,跑胶的条带也异常的亮,但产物不是自己想要的质粒,要特别注意一下。

q 【Trans 实验常见问题和解答】质粒提取--为什么加了溶液Ⅱ后,菌体没有逐渐由混浊变澄清?提出来 的条带几乎没有,但是RNA很亮(没加RNA酶)?

a 1)可能是因为溶液储存不当,或屡次操作没有及时盖好溶液瓶盖,导致其吸收空气中的CO2失效。 RNA在菌体中量较多,相对少量的菌体裂解,可有较DNA明显的条带。
2)可能是菌量大,加溶液Ⅱ后,菌体并不能完全裂解,所以没有变清,这也会导致质粒产率低下。
3)可能是质粒的拷贝数不高,质粒产率不高.如果是使用自己配的试剂,建议做中提或大提;或者买试剂盒提.用自己配的试剂,不加RNA酶,最后RNA是很亮的,要去除干净就要用比较好的RNA酶。
4)如果不是试剂的原因,可能是质粒表达的过程中使膜蛋白变化(数量变多),很难使用碱裂解法,可以尝试用其他比较剧烈的方法(比如高温或者低温研磨等),然后使用一般的发放。
5) 可能质粒随乙醇一起倒掉了。

q 【Trans 实验常见问题和解答】质粒提取--细菌离心加入缓冲液涡旋振荡后,发现菌体呈絮状不均匀或 呈细砂状?

a 1)很可能是细菌发生溶菌,可减少培养时间或者试试平板培养,质粒提取前用PBS将菌落洗下,相较来说固体培养基上细菌生长的要好一些。
2)质粒抽提过程很大程度上是受细菌生长情况决定的,刚活化的菌比负80℃保存菌种所培养出来的菌液状态好,保存久的菌株可能会造成质粒浓度低,质粒丢失等不明原因。
3)判断生长的菌液是否正常,可以用肉眼观察,在光线明亮处摇荡新鲜培养液,如果发现菌液呈漂絮状,情况很好。如果发现呈泥水状,即看不到絮状,只是感觉很浑浊,则可能提不出好的质粒,或者没有质粒。
4) 菌液不宜生长太浓,摇床速度不宜过高。达到OD600 1.5就可以了,(尤其是对于试剂盒提取要注意)另外如果只是简单的酶切验证根本无需酚氯仿抽提(安全考虑,慎重),只要溶液I/ II /III比例恰当,转管过程仔细吸取不会有太多杂质。

q 【Trans 实验常见问题和解答】质粒提取--为什么要用pH8的Tris水溶液饱和酚?呈粉红色的酚可否使用? 如何保存酚不被空气氧化?

a 因为酚与水有一定的互溶,苯酚用水饱和的目的是使其抽提DNA过程中, 不致吸收样品中含有DNA的水分,减少DNA的损失。用Tris调节至pH为8是因为DNA在此条件下比较稳定。在中性或碱性条件下(pH5~7),RNA比DNA更容易游离到水相,所以可获得RNA含量较少的DNA样品。
保存在冰箱中的酚,容易被空气氧化而变成粉红色的,这样的酚容易降 解DNA,一般不可以便用。为了防止酚的氧化,可加入疏基乙醇和8-羟基喹琳至终浓度为0.1%。8-羟基喹琳是带有淡黄色的固体粉末,不仅能抗氧化,并在一定程度上能抑制DNase的活性,它是金属离子的弱螯合剂。用Tris pH8.0水溶液饱和后的酚,最好分装在棕色小试剂瓶里,上面盖一层Tris水溶液或TE缓冲液,隔绝空气,以装满盖紧盖子为宜,如有可能,可充氮气,防止与空气接触而被氧化。平时保存在4℃或-20℃冰箱中,使用时,打开盖子吸取后迅速加盖,这样可使酚不变质,可用数月。