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q 【Trans 实验常见问题和解答】RNA提取 -- 关于RNA样品中基因组DNA污染的问题

a 1) 引物设计阶段:在引物设计时,设计跨内含子的上下游引物。这样在反转录结束后,可以根据扩增片段大小判断是否有gDNA的污染。然而这种方法有个缺点:仅适用于已知序列,未知序列此方法不奏效。
2) RNA提取阶段:使用手提法提取时,氯仿分相后吸取上清时切记一个原则:吸取上清宁少勿多。一定不要用枪头触及中间相。用200μl移液器多吸几次比用1ml移液器吸一次污染gDNA的危险性要小很多。另外,很重要的一点,起始材料宁少勿多(其实,这对提取到高质量的RNA同样重要),如果50mg材料得到的RNA能胜任RT需要,不要用100mg。实验时,最好先少用材料,根据提取效果再逐渐增加样品起始量。当然,做Northern的话另当别论(Northern也勿须过份担心gDNA的污染)。当使用试剂盒离心柱方法提取RNA时,gDNA污染要比用TRNzol方法要更加严重。Protocol中一般建议在离心柱上进行
DNase的消化(下面有详细介绍)。
3) RNA样品的处理:
① DNase消化
② PC抽提(phenol-chloroform extraction)
③ LiCl沉淀。
其中DNase消化和PC抽提都能有效去除gDNA污染,而LiCl沉淀方法不能有效去除gDNA污染。DNase消化RNA的关键一步是将消化后样品中的残余酶活性完全灭活,否则RT中它将会降解cDNA。

q 【Trans 实验常见问题和解答】RNA提取 -- RNA质量检测与鉴定

a 1)检测RNA溶液的吸光度
280、320、230、260nm下的吸光度分别代表了核酸、背景(溶液浑浊度)、盐浓度和蛋白等有机物的值。一般的,我们只看OD260/OD280(Ratio,R)。A260/A280是衡量蛋白质污染程度的指标,2.0是高质量RNA的标志,但受二级结构等的影响,读数可能会有一些变化,高质量的RNA, A260/A280读数(10mMTris,pH7.5)在1.8-2.1之间,有时甚至>2.1。有资料指出:同一个RNA样品,假定在10mM Tris,pH7.5溶液中测出的A260/A280读数1.8-2.1之间,在水溶液中所测读数则可能在1.5-1.9之间,原因是因为A260/A280读数受测定所用溶液的pH值影响。当R<1.8时,溶液中蛋白或者其他有机物的污染比较明显,你可以根据自己的需要决定这份RNA的命运。当R>2.2时,说明RNA已经水解 成单核酸了。另外,需要注意的是,样品的稀释倍数要使得分光光度计的读数在0.15-0.5之间,因为此时线性最好,读数准确 。
2)RNA的电泳图谱
一般的,RNA的电泳都,用普通的琼脂糖胶就可以了。电泳的目的是在于检测28S和18S条带的完整性和他们的比值,或者是mRNA smear的完整性。一般的,如果28S和18S条带明亮、清晰、条带锐利(指条带的边缘清晰),并且28S的亮度在18S条带的两倍以上。
3)保温试验
方法很简单,按照样品浓度,从RNA溶液中吸取两份1000 ng的RNA加入至0.5 ml的离心管中,并且用pH7.0的Tris缓冲液补充到10 ul的总体积,然后密闭管盖。把其中一份放入70℃的恒温水浴中,保温1 h。另一份放置在-20℃冰箱中保存1 h。时间到了之后,取出两份样本进行电泳。电泳完成后,比较两者的电泳条带。如果两者的条带一致或者无明显差别,则说明RNA溶液中没有残留的RNA酶污染,RNA的质量很好。相反的,如果70℃保温的样本有明显的降解,则说明RNA溶液中有RNA酶污染。

q 【Trans 实验常见问题和解答】RNA提取 -- RNA抽提中自备有机溶液的配制及保存问题

a RNA抽提中涉及的有机试剂包括苯酚、氯仿、异丙醇、乙醇等。苯酚的使用和保存:
苯酚基本已经商品化,选择和保存都不应该有什么问题,4℃避光保存即可;
只强调一点:尽管Tris饱和的苯酚也可以用于RNA的抽提,但使用水饱和苯酚会更好一些,因为RNA在pH7以上的溶液中,发生降解的机率大大提高。
下面是关于氯仿、异丙醇、乙醇的有关建议。
选择:国内大的化学试剂公司生产或者监制的分析纯级别试剂(AR)就完全可以满足要求。
预处理:不需要进行任何的预处理。绝对不可以高温高压灭菌,这三种试剂的沸点都低于 100℃,高温高压可能导致危险。
75% 乙醇的配制
一份无菌无酶的水(DEPC水)与 3 份 (体积)无水乙醇混匀即成。不要使用量筒等过渡容器。事实上,70% - 80% 的乙醇都具有较好的洗涤能力,使用都不会导致片段比较大的核酸的丢失,所以,配制时就不要为了准确而左勾右兑。75% 乙醇也不可以高温高压灭菌,原因同无水乙醇。
保存:
1) 要使用新的未开封的试剂,用后做好标记。
2)分成相对小一点的包装 (50ml – 100ml); 500ml 的瓶子取液是非常不方便的,移液器的杆子往往都进入了瓶口里,非常容易造成污染。
3) 塑料瓶子密闭性好,装醇类试剂是非常好的选择;但氯仿绝对不要使用塑料瓶子。
4)盖紧瓶盖,作好标记。
5) 保存于室温。将有机试剂保存于冰箱的人不在少数,但这么做却是令人奇怪的。首先,任何挥发性的东西都不保存在冰箱 (除非万不得已,如 DEPC)。其次,与外面相比,冰箱除了灰尘少一点外,什么都会比外面多。第三,在室温打开低温的瓶子,将导致空气大量进入瓶子,增加了污染的风险。
使用:
非常幸运的是,有机试剂对菌污染和酶污染似乎有我们想象不到的抑制和灭活作用,所以,使用这些试剂没有特殊的要求,按正常抽提 RNA 的要求就完全可以了。吸取有机试剂时,最好使用比要吸取的体积大的移液器,因为有机试剂有越吸越多的现象,试剂容易接触到移液器的杆头,污染不说,氯仿还会腐蚀杆头。

q 【Trans 实验常见问题和解答】RNA提取 -- RNA提取得率低

a 1) 该组织或者细胞中RNA含量偏低:不同细胞和组织中RNA的丰度不同,如肝脏,胰腺,心脏等是高丰度组织(总RNA含量2-4μg/mg),脑,胚胎 ,肾脏,肺,胸腺,卵巢等是中丰度组织(总RNA含量0.05-2μg/mg),膀胱,骨,脂肪等是低丰度组织(总RNA含量<0.05μg/mg)。
2) 组织起始量太少或者太多:样品量过少,则细胞组织中RNA含量较低;样品量过多则可能超过裂解液的裂解能力,裂解将不完全,从而导致RNA得率低。

q 【Trans 实验常见问题和解答】RNA提取 -- OD260/OD280比值偏低

a 1) 蛋白质污染:确保不要吸入中间层及有机相。减少起始样品量,确保裂解完全、彻底。加入氯仿后首先要充分混匀,并且离心分层的离心力和时间要足够。如果所得RNA的OD260/OD280比值偏低,则用氯仿重新抽提一次,再沉淀,溶解。
2)苯酚残留:确保不要吸入中间层及有机相。加入氯仿后首先要充分混匀,并且离心分层的离心力和时间要足够。
3)多糖或多酚的残留:一些特殊的组织和植物中,多糖、多酚含量较多,这些残留也会导致OD260/OD280比值偏低。因此,从这类材料中提取RNA时,需要注意多糖、多酚杂质的去除。
4)设备限制:测定OD260及OD280数值时,要使OD260读数在0.1-0.5之间。此范围线性最好。用水稀释样品:测OD值时,对照及样品稀释液请使用10mM Tris,pH7.5。用水作为稀释液将导致比值偏低。