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q 【Trans 实验常见问题和解答】基因组提取 -- 基因组提取量少,或者提不出来

a 1、可能原因:
所提样品材料老化或反复冻融导致基因组DNA含量下降
对策:
应选择新鲜的样品材料,如新鲜血液、新鲜菌液、刚离体的动物组织或幼嫩的植物组织等,不能即时处理的样品应立即放入液氮或-70℃低温保存,以免DNA降解。
2、可能原因:
样品破壁或裂解不完全导致基因组DNA未充分释放
对策:
动、植物材料应在液氮中充分研磨匀浆,G+细菌、酵母等破壁较困难的样 品应用溶菌酶、酵母破壁酶或机械方式协助破壁。
3、可能原因:
样品量过多导致细胞裂解不充分
对策:
加样量过多使裂解液和样品混合不均匀,细胞裂解不充分。不同来源样品的加样量请参照详细操作步骤。
4、可能原因:
DNA吸附不充分
对策:
如在上吸附柱前末加无水乙醇,或用低浓度乙醇代替无水乙醇,则导致DNA不能充分沉淀,与硅胶膜吸附不彻底,因此应在样品裂解后加适量无水乙醇,再上吸附柱使DNA与硅胶膜充分吸附。
5、可能原因:
DNA洗脱不适当
对策:
如在上吸附柱前末加无水乙醇,或用低浓度乙醇代替无水乙醇,则导致DNA不能充分沉淀,与硅胶膜吸附不彻底,因此应在样品裂解后加适量无水乙醇,再上吸附柱使DNA与硅胶膜充分吸附。
6、可能原因:
DNA洗脱不适当
对策:
洗脱液pH值过低会降低洗脱效率,应确保洗脱液pH值在7.0-8.5之间;洗脱 体积若小于30μ,则不易完全浸透硅胶膜,使DNA不能全部洗脱下来,因此洗脱液体积应大于30 μl,同时如洗脱液体积过大,超过200μl,则所得的DNA浓度会降低,但DNA总量不会减少;洗脱时可将洗脱缓冲液在65-70℃水浴预热,加入洗脱液后在室温静置2-5分钟,可提高洗脱效率,提高基因组DNA的产量。

q 【Trans 实验常见问题和解答】RNA提取 -- RNase 和 DEPC 处理

a 1)高压灭菌是可以灭活部分 Rnase A 的。实验证明:37℃与 RNA 反应,没有灭菌的 PBS,活性点为 100 pg/ml;灭菌后,活性点为 100 ng/ml。当然,灭菌后 Rnase 仍然不能认为没有残留。
2)DEPC 在水中半衰期为 30 分钟。0.1% 的 DEPC 灭菌 15 分钟可以认为彻底破坏了 DEPC。破坏后可以闻到一点气味。
3)在1M Tris, 1M HEPES, 1M MOPS 中分别加入 1ug/ml Rnase A 和 0.1% 及 1% DEPC 实验。结果提示,0.1% DEPC 只对 MOPS 有效,而 1% DEPC 对三种试剂都有效。
4) 0.01% DEPC,0.1% DEPC,1% DEPC 有效去除 Rnase A 的浓度分别为:100 ng/ml,500ng/ml,1 ug/ml。但要注意,DEPC 灭活后的副产品,对有些后续实验是有影响的。

q 【Trans 实验常见问题和解答】RNA提取 -- RNase 污染的10大来源

a 1)手指头 - 手指头是外源酶的第一来源,所以必需戴手套并且频繁更换。另外,口罩也必需戴,因为呼吸也是一个重要的酶来源。戴手套口罩的另外的好处是保护实验人员。
2)枪头,离心管,移液器 - 单纯的灭菌是不能灭活 Rnase 的,所以枪头和离心管要用 DEPC 处理,即使是标明为 DEPC 处理过的。 移液器最好是专用的,用前用 75% 的酒精棉球搽拭干净,尤其是杆子;另外,一定不要使用褪头器褪头。
3)水/缓冲液 - 一定要确保无 Rnase 污染。
4)实验台面 - 最起码要用 75% 的酒精棉球搽拭干净。
5)内源 Rnase - 所有组织均含内源酶,故组织用液氮速冻是降低降解的最好办法。液氮保存/碾磨方法的确不方便,但对有一些内源酶含量很高的组织,却是唯一的办法。
6)RNA 样品 - RNA 抽提产物可能都会含痕量的 Rnase 污染。
7)质粒抽提 - 质粒抽提往往用到 Rnase 降解 RNA。
8)RNA 保存 - 即使低温保存,痕量的 Rnase 亦会导致 RNA 降解。长期保存 RNA 的最好办法是盐/醇悬液,因为醇在低温时抑制所有的酶活性。
9)阳离子 (Ca, Mg) - 在含这些离子时,80C加热 5 分钟会导致 RNA 被剪切,故如果 RNA 需要被加热,保存液需要含螯合剂。
10)后续实验所用的酶 - 酶均有可能被 Rnase 污染。

q 【Trans 实验常见问题和解答】RNA提取 -- RNA 抽提的注意事项

a 1)严格戴好口罩,手套。
2)实验所涉及的离心管,Tip 头,移液器杆,电泳槽,实验台面等要彻底处理。
3)实验所涉及的试剂/溶液,尤其是水,必须确保 RNase-Free。
4)阻止内源酶的活性 。
5)选择合适的匀浆方法。
6)选择合适的裂解液。
7)控制好样品的起始量。
8)明确自己的抽提目的 。
9)任何裂解液系统在接近样品最大起始量时,抽提成功率急剧下降。
10)RNA 抽提成功的唯一经济的标准是后续实验的一次成功,而不是得率。

q 【Trans 实验常见问题和解答】RNA提取 -- 特殊组织的抽提

a 纤维组织:心脏/骨骼肌等纤维组织抽提 RNA 关键在彻底破碎组织。这些 组织细胞密度低,故单位重量的组织 RNA 的含量就少,最好用尽可能多的起始量。一定要在冷冻条件下将组织彻底磨碎。
蛋白/脂肪含量高的组织:脑/植物脂肪含量高,抽提后,上清含白色絮 状物。必须用氯仿再次对上清进行抽提。
核酸/核酶含量高的组织:脾/胸腺等核酸和核酶含量很高。在冷冻条件 下碾磨组织,再快速匀浆,能有效灭活核酶。但如果裂解液太粘稠 (因为核酸含量高的缘故), 抽提不能有效分层;加入更多裂解液可以解决此问题。多次抽提可以去除更多残留的 DNA。如果加入醇后马上有白色沉淀形成提示有 DNA 污染。溶解后 再次抽提,可以去除 DNA 污染。