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q 【Trans 实验常见问题和解答】原核表达 -- T7表达系统较高的本底转录如何解决

a 解决方案: 在表达系统中低水平表达T7溶菌酶基因:因为T7溶菌酶除了作用于大肠杆菌细胞壁上肽聚糖外,还能与T7 RNA聚合酶结合抑制其转录的活性。目前T7溶菌酶基因都通过共转化质拉导入表达系统,它能明显降低本底转录,但对诱 导后目的基因的表达水平无明显影响。

q 【Trans 实验常见问题和解答】原核表达 -- 如何降低包涵体的形成?

a 解决方案:
(1)采用胰胨-磷酸盐培养基能够限制包含体的形成。
(2)培养液中加入甜菜碱和山梨醇来改变渗透压,使表达产物由包含体形式转变为活性状态,将温度从37℃降低到25℃时诱导表达,可降低包含体的形成。
(3)选用pMBI衍生而来的载体质粒,因为其可以协同表达DnaK-DnaJ或 GroEL-GroES,增加凝结蛋白的溶解度。分子伴侣折叠作用效率与细胞DnaK-DnaJ和GroEL-GroES的浓度有关,与表达蛋白的性质有关。

q 【Trans 实验常见问题和解答】基因组提取 -- 提取的基因组 DNA 不能顺利地进行后续试验

a 1、可能原因:
样品量过多导致细胞裂解不充分
对策:
样品量过多会使裂解液不能快速有效地与样品充分混合,从而导致样品裂解不彻底,残留大量蛋自、多糖、脂类等杂质,为后续的上吸附柱分离纯化造成影响。应加入适当量的样品材料。
2、可能原因:
DNA在洗脱前有大量乙醇残留
对策:
有机溶剂乙醇可严重抑制内切酶、DNA聚合酶的活性,而在DNA过柱洗涤过程中需使用含有乙醇的漂洗液,因此在洗脱DNA前,—定要充分去除残留的乙醇,可重复离心,或将吸附柱置于室温或50℃温箱中烘干5-10分钟,再加洗脱液。

q 【Trans 实验常见问题和解答】基因组提取 -- 提取的基因组 DNA 中有 RNA 污染

a 1、可能原因:
实验过程中没有有效使用RNase A
对策:
应严格按照实验操作要求使用。
2、可能原因:
RNAase A可能失活
对策:
RNase A须在-20℃下保存,低温保存时RNase A比较稳定,不易失活,但如果反复冻融会导致RNase A降解失活,所以应妥善保存。

q 【Trans 实验常见问题和解答】基因组提取 -- 提取的基因组 DNA 有降解

a 1、可能原因:
选取的材料不新鲜或反复冻融,采集材料后未及时处理或末低温保存。
对策:
陈旧血液、老化菌液等不新鲜的材料中,细胞凋亡导致DNA降解,或低温保存的样品反复冻融导致细胞破碎,内源核酸酶降解DNA,因此应选择新鲜的材料样品,不能及时处理则低温保存,运输过程中亦应使用干冰。
2、可能原因:
未能有效抑制内源核酸酶作用
对策:
某些DNase含量较丰富的动、植物组织样品应在液氮中研磨或匀浆,研 磨过程中应随时补充液氮,并在样品末完全解冻前即加入含有抑制核酸酶作用的鳌合剂的裂解液。
3、可能原因:
操作过于剧烈导致DNA被机打断
对策:
预处理的样品加入细胞裂解液后,所有操作应尽量柔和,避免振荡、搅拌等剧烈机械力对DNA片段的损伤。