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q 【Trans 实验常见问题和解答】细胞水平检测 -- 细胞增殖活性检测注意事项

a 1) 选择适当的细胞接种浓度。一般情况下,96孔培养板的一内贴壁细胞长满时约有10^5个细胞。但由于不同细胞贴壁后面积差异很大,因此,在进行MTT试验前,要进行预实验检测其贴壁率、倍增时间以及不同接种细胞数条件下的生长曲线,确定试验中每孔的接种细胞数和培养时间,以保证培养终止致细胞过满。这样, 才能保证MTT结晶形成酌量与细胞数呈的线性关系。否则细胞数太多敏感性降低,太少观察不到差异。
2) 药物浓度的设定。一定要多看文献,参考别人的结果再定个比较大的范围先初筛。根据自己初筛的结果缩小浓度和时间范围再细筛。切记!否则,可能你用的时间和浓度根本不是药物的有效浓度和时间。
3) 时间点的设定。在不同时间点的测定OD值,输入excel表,最后得到不同时间点的抑制率变化情况,画出变化的曲线,曲线什么时候变得平坦了(到了平台期)那个时间点应该就是最好的时间点(因为这个时候的细胞增殖抑制表现的最明显)。
4) 培养时间。200ul的培养液对于10的4~5次方的增殖期细胞来说,很难维持68h,如果营养不够的话,细胞会由增殖期渐渐趋向G0期而趋于静止,影响结果,我们是在48h换液的。
5) MTT法只能测定细胞相对数和相对活力,不能测定细胞绝对数。做MTT时,尽量无菌操作,因为细菌也可以导致MTT比色OD值的升高。
6) 理论未必都是对的。要根据自己的实际情况调整。
7)实验时应设置调零孔,对照孔,加药孔。调零孔加培养基、MTT、二甲基亚砜。对照孔和加药孔都要加细胞、培养液、MTT、二甲基亚砜,不同的是对照孔加溶解药物的介质,而加药组加入不同浓度的药物。
8)避免血清干扰。用含15%胎牛血清培养液培养细胞时,高的血清物质会影响试验孔的光吸收值。由于试验本底增加,会试验敏感性。因此,一般选小于10%胎牛血清的培养液进行。在呈色后,尽量吸净培养孔内残余培养液。

q 【Trans 实验常见问题和解答】细胞水平检测 -- 双荧光素酶报告基因检测结果

a 检测前应检测孔板或空管的发光值,作为仪器发光背景值,Modulus多功能检测仪的仪器背景值应小于100;
样品检测发光值应该远大于仪器背景值,例如10000。如果样品发光值过于接近仪器背景值,说明样品中荧光素酶过少,需要考虑转染量、转染效率、裂解效率等因素。

q 【Trans 实验常见问题和解答】细胞水平检测 -- 双荧光素酶报告基因最适反应温度

a 室温(20-22℃)。各个组分(细胞裂解产物,底物工作液等)都需要调整到室温。

q 【Trans 实验常见问题和解答】细胞水平检测 -- 双荧光素酶报告基因的载体比例

a 根据实验具体情况调整。建议作一个预实验来调整(萤火虫载体与海肾载体比例分别用1:10、1:20、1:50、1:100),萤火虫荧光素酶检测发光值大于海肾荧光素酶发光值的比例较好。

q 【Trans 实验常见问题和解答】细胞水平检测 -- 报告基因检测注意事项

a 1) 报告基因检测受多种因素影响(载体状态、细胞状态、转染量、转染效率、裂解效率、加样精度、检测过程等),因此同批次样品检测值也可能出现浮动。所以实验一般需要做3个或3个以上复孔,并且引入另一个报告基因作为内参。
2)细胞培养时间不宜过长,12-36h内最好;长时间培养后,细胞难裂解。
3)双荧光素酶报告基因的载体选择:
a)萤火虫荧光素酶建议选取pGL-3或pGL-4的载体或自己构建相应的载体;
b)海肾荧光素酶建议选取phRL-TK或pGL-4代载体或自己构建相应的载体。建议海肾载体不使用强启动子(如SV40、CMV),而选用中等强度的启动子(如TK)。